多克隆抗體的免疫電泳實(shí)驗(yàn)

　　【實(shí)驗(yàn)原理】

　　免疫電泳又稱為γ球蛋白電泳或免疫球蛋白電泳技術(shù)，這是一種能夠判斷血液中三種免疫球蛋白IgM’’ IgG’’ IgA含量水平的實(shí)驗(yàn)方法。在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中，首先利用蛋白質(zhì)的分子量和所帶電荷的比值運(yùn)用水平瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，然后將特異性的抗體引入到與電泳方向平行的凹槽中，在抗原和抗體的擴(kuò)散過(guò)程中，抗原和抗體適當(dāng)比例的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致沉淀的產(chǎn)生(如圖)。0.85%鹽不僅可以終止擴(kuò)散過(guò)程也可用于洗去未結(jié)合的蛋白，抗原和抗體結(jié)合所形成的沉淀線即可以肉眼觀察也可利用染色方法觀察。

　　免疫電泳技術(shù)不僅可用于血清或尿樣中單克隆抗體的鑒定，也可用于其它方面，比如免疫復(fù)合物的篩選、各種異常丙種球蛋白血癥的識(shí)別和鑒定等。免疫電泳技術(shù)也是進(jìn)行蛋白質(zhì)常規(guī)評(píng)價(jià)的一種可靠，精確的實(shí)驗(yàn)方法，可觀察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化和濃度的改變。

　　【實(shí)驗(yàn)材料】

　　⒈ 實(shí)驗(yàn)器材

　　水平電泳儀;打孔器;滴管;刀片;電源;水浴(55°C);蒸餾水;燒杯(400-600ml);

　　加樣槍(5-100ul)。

　�、� 實(shí)驗(yàn)試劑

　　⑴ 純化的抗體;蛋白質(zhì)混合物;1%瓊脂。

　�、� Tris-巴比妥緩沖溶液：2.24g 巴比妥酸，4.43g Tris，0.053g 乳酸鈣及0.065g 疊氮化鈉溶于100ml 蒸餾水中。

　�、� 電泳緩沖溶液：將Tris-巴比妥緩沖溶液與蒸餾水按1：4的比例混合。

　　【實(shí)驗(yàn)方法】

　�、� 準(zhǔn)備瓊脂糖凝膠

　　將瓊脂和電泳緩沖溶液混合放入90°C水浴加熱至溶化，制成1%瓊脂，將瓊脂在冷卻前鋪在水平玻璃板上，待冷卻至室溫后，按圖用內(nèi)徑4毫米的打孔器打孔及制作凹槽。

　　⒉ 電泳

　　將用電泳緩沖溶液稀釋的4%-5%的抗原用滴管小心放入小孔中，將膠板放入電泳槽中并用潤(rùn)濕的濾紙將膠板和電泳槽中的緩沖溶液相連。蓋上電泳槽蓋，接通電源，6V/cm通電至前沿移動(dòng)約35mm，時(shí)間約為1小時(shí)，利用示蹤染料判斷移動(dòng)距離。

　　⒊ 擴(kuò)散

　　將膠板移出電泳槽并放在水平位置上’’用濾紙潤(rùn)干膠板凹槽中的緩沖溶液’’在凹槽中加入適量的抗體(0.2ml~0.25ml)，注意抗體不能溢出凹槽以避免污染.將膠板移至含有疊氮化鈉且有一定濕度的盒內(nèi)’’加蓋密封后在30°C水浴擴(kuò)散至少10小時(shí)后，移至0.85%鹽水中以終止擴(kuò)散并洗去未結(jié)合的蛋白。

　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

　　觀察抗原和抗體之間所形成的沉淀線，并進(jìn)行記錄。