免疫組化問題解答

　　1、染色過強(qiáng)

　　原因 解決方法

　　a 抗體濃度過高或孵育時(shí)間過長 降低抗體滴度、抗體孵育時(shí)間：室溫1小時(shí)或4度過夜

　　b 孵育溫度過高超過37度 一般在室溫20-28

　　c DAB顯色時(shí)間過長或濃度過高 顯色時(shí)間不超過5-12分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)

　　2、非特異性背景染色

　　原因 解決方法

　　a 操作過程中沖洗不充分 每步?jīng)_洗3次每次5分鐘

　　b 組織中含過氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3%H2O2封閉孵育時(shí)間延長

　　c 組織中含內(nèi)原性生物素 正常非免疫動(dòng)物血清再封閉

　　d 血清蛋白封閉不充分 延長血清蛋白封閉時(shí)間

　　3、染色弱

　　原因 解決方法

　　a 抗體濃度過低、孵育時(shí)間過短 提高抗體濃度、孵育時(shí)間不能少 于60分鐘

　　b 試劑超過有效使用時(shí)間 應(yīng)更換試劑

　　c 操作中添加試劑時(shí)緩沖液未瀝干 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液

　　使試劑稀釋 (應(yīng)防止切片干燥)

　　d 室溫太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘或4 度冰箱過夜

　　e 蛋白封閉過度 封閉不要超過12分鐘

　　4、染色陰性

　　原因 解決方法

　　a 操作步驟錯(cuò)誤 應(yīng)重試 設(shè)陽性對照

　　b 組織中無抗原 設(shè)陽性對照以驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

　　c 一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤 仔細(xì)確定一抗二抗種屬無誤